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四川省現(xiàn)行主推家蠶品種資源對(duì)BmNPV的抗性研究

袁桂陽(yáng)¹ 曹寧寧¹ 王少伯¹ 龔大剛² 文廷勇¹ 何艷茹¹

（1.四川省南充蠶種場(chǎng)，四川 南充637000；2.四川省閬中蠶種場(chǎng)，四川 閬中637400）

摘要 BmNPV（核型多角體）病毒病是養(yǎng)蠶生產(chǎn)上最常見(jiàn)、危害最嚴(yán)重的一類(lèi)蠶病，選育對(duì)BmNPV高抗力的家蠶品種是家蠶品種選育的主要攻關(guān)課題之一。為了摸清四川現(xiàn)行蠶品種資源對(duì)BmNPV的抗性，以及和國(guó)內(nèi)高抗BmNPV蠶品種的差異，本文通過(guò)人工經(jīng)口添食BmNPV病毒的方法對(duì)川山、蜀水等20多個(gè)四川省主要家蠶品種的抗BmNPV性能進(jìn)行了檢測(cè)，旨在掌握不同品種對(duì)BmNPV抗性差異，篩選對(duì)BmNPV高抗性的育種素材，為選育BmNPV高抗病品種奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果顯示：不同品種對(duì)BmNPV抗性存在顯著差異，其中 871c、872c對(duì)BmNPV的半數(shù)致死濃度（LC₅₀）均達(dá)10⁹ p/mL以上，對(duì)BmNPV的抗性顯著。其它品種對(duì)BmNPV的半數(shù)致死濃度（LC₅₀）分布在10⁴~10⁵ p/mL范圍內(nèi)，對(duì)BmNPV的抗性差異不明顯。

關(guān)鍵詞 蠶病 核型多角體 抗性 半數(shù)致死濃度

Appraisal Study on the Resistance of Main Push Bombyxmori Breed to BmNPV

Yuan Guiyang¹ Cao Ningning¹ Wang Shaobai¹ Gong Dagang² Wen Tingyong¹ He Yanru¹ 

 (¹Sichuan Province Nanchong Silkworm Eggs Farm, Nanchong Sichuan 637000,China; ²Sichuan Province Langzhong  Silkworm Eggs Farm, Langzhong Sichuan 637400,China; )

Abstract BmNPV is one of the most common and serious silkworm disease. Breeding of BmNPV-high resistance of the silkworm variety is the main research topic of current variety breeding. In order to grasp the difference between different silkworm varieties of BmNPV resistance and the difference of BmNPV-high resistance between varieties in domestic, we had tested the BmNPV resistance of current main silkworm varieties in Sichuan province like Chuanshan and Shushui through artificial mouth lick. The aim of this study was to investigate different resistance of silkworm varieties to BmNPV, and to screen breeding materials with high resistance to BmNPV, which laid the foundation of BmNPV high resistant varieties breeding. The test results showed that the resistance to BmNPV between different varieties was significant and 50% lethal concentration of 871c and 872c to BmNPV was 10⁹ p/ml. The differences between the other varieties of the resistance to BmNPV was not significant, and the median lethal concentration (LC₅₀) ranged from 10⁴ to 10⁵ p/ mL.

Keywords Bombyxmori diseases; Nuclear polyhedrosis virus; Resistance; 50% lethal concentration

在影響?zhàn)B蠶生產(chǎn)的眾多因素中，蠶病的發(fā)生是最大的影響因素，往往導(dǎo)致大量病死蠶的發(fā)生，甚至絕收，嚴(yán)重影響?zhàn)B蠶效益和養(yǎng)蠶積極性，進(jìn)而影響產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。據(jù)蠶病普查結(jié)果，養(yǎng)蠶損失中，70%來(lái)自蠶病，因家蠶病毒病所造成的損失約占總蠶病損失的70～80%，而BmNPV病毒病又占到病毒病的60%以上。BmNPV病毒病是養(yǎng)蠶生產(chǎn)上最常見(jiàn)、危害最嚴(yán)重的一類(lèi)蠶病。特別是20世紀(jì)80年代以來(lái)，BmNPV病毒病已成為我國(guó)主要蠶區(qū)危害最嚴(yán)重的蠶病。提高家蠶抗病性，培育高抗病蠶品種已成為家蠶育種的重要課題和蠶桑產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要保障^[1]。其中，BmNPV流行規(guī)律以及家蠶對(duì)BmNPV的抗性遺傳規(guī)律研究是培育對(duì)BmNPV高抗病蠶品種，提高家蠶抗病性的理論基礎(chǔ)。目前，對(duì)于BmNPV的傳播流行規(guī)律已基本探明。隨著家蠶基因組的破譯，家蠶對(duì)BmNPV抗性遺傳規(guī)律的研究也將取得更大突破。已有研究證明，不同蠶品種對(duì)BmNPV的抵抗性存在差異，為選育抗病品種奠定基礎(chǔ)^[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，家蠶對(duì)BmNPV的抗性為不完全顯性遺傳，即受常染色體上的主效基因控制，又受性染色體上相關(guān)基因的影響^[4]。我們對(duì)我省現(xiàn)行主要品種資源進(jìn)行了BmNPV抗性鑒定試驗(yàn)，測(cè)定了不同品種資源對(duì)BmNPV的半數(shù)致死濃度（LC₅₀），對(duì)于進(jìn)一步研究BmNPV抗性遺傳機(jī)制，選育抗BmNPV家蠶品種，抵御蠶病風(fēng)險(xiǎn)，促民增收和維持蠶桑產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

1、材料和方法

1.1供試材料

1.1.1蠶品種

    川山B、夏芳、932、芙蓉、871A、菁松A、限1、秋豐、蒼松、碧海、蜀繡、蜀水B、秋白、7532、湘輝、872A、皓月A、限2、854B、日新、星月、渝春由四川省南充蠶種場(chǎng)繁育保存，871c、872c由中國(guó)蠶業(yè)研究所引進(jìn)繁育。

1.1.2核型多角體病原

原始BmNPV病原由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供，由我場(chǎng)對(duì)原始病原進(jìn)行復(fù)壯、擴(kuò)繁。

1.1.3 試驗(yàn)地點(diǎn)

四川省南充蠶種場(chǎng)蠶品種改良研究室試驗(yàn)組。

1.1.4 試驗(yàn)時(shí)間

    BmNPV病原的復(fù)壯于2016年4月進(jìn)行，BmNPV病原的擴(kuò)繁于2016年5月進(jìn)行，參試品種半致死濃度（LC₅₀）測(cè)定于2016年6月進(jìn)行。

1.2方法

1.2.1病毒復(fù)壯及擴(kuò)繁

病原復(fù)壯采用經(jīng)口添食的方法進(jìn)行，家蠶3齡響食第二次給桑時(shí)添食原始病毒。添食初始病毒濃度：1×10⁷ p/mL，采用25 mm打孔器打孔桑葉，打孔后的桑葉用塑料勺子將初始病毒BmNPV 50 uL均勻涂抹在桑葉上，給桑，采用常規(guī)飼育操作飼養(yǎng)，觀察添食病毒蠶的生長(zhǎng)發(fā)育情況。收集典型膿病病死蠶，先用研缽將其磨碎，用雙層紗布過(guò)濾2次。然后將收集的過(guò)濾液，4000 rpm離心10 min，去上清；重復(fù)離心三次，收集沉淀，4℃保存，備用。

病毒擴(kuò)繁采用注射方式進(jìn)行，五齡響食第二次給桑后，將以上復(fù)壯后的NPV病毒注射到家蠶腹部8-9環(huán)節(jié)，每頭家蠶注射2 uL。接種病毒4、5天后，待大批發(fā)病時(shí)，收集病蠶，用解剖剪將蠶腹足全部剪掉，將蠶放于雙層紗布上自然流出蠶血并進(jìn)行過(guò)濾，濾去雜質(zhì)，將收集的蠶血，800 rpm離心10 min，去沉淀，重復(fù)離心三次。將收集的上清液4000 rpm離心10 min，去上清；加入純凈水，攪拌，再用4000 rpm離心10 min。重復(fù)離心三次，去上清，收集沉淀，4℃保存，備用。

1.2.2病毒計(jì)數(shù)

   用血球計(jì)數(shù)器對(duì)制備病毒樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，4℃保存，備用。要求病毒濃度達(dá)到1.0×10⁹ p/mL以上，病毒使用前要重新進(jìn)行計(jì)數(shù)，誤差要求控制在相同數(shù)量級(jí)范圍之內(nèi)。

1.2.3  不同品種對(duì)BmNPV半數(shù)致死濃度（LC₅₀）測(cè)定

1.2.3.1區(qū)組設(shè)置。先用蒸餾水稀釋病毒，確保病原溶液分散混勻，每個(gè)品種添食BmNPV病毒多角體1×10⁵p/mL、1×10⁶ p/mL、1×10⁷ p/mL、1×10⁸ p/mL、1×10⁹ p/mL，共設(shè)5級(jí)濃度，先配兌高濃度病毒，然后依次逐級(jí)向低濃度稀釋?zhuān)ㄈ?/font>1份病毒，加蒸餾水9份）。每處理3個(gè)重復(fù)，共15區(qū)，每試驗(yàn)區(qū)定蠶100頭。為保證數(shù)蠶時(shí)不傷蠶體，采用加網(wǎng)后連同蠶網(wǎng)數(shù)蠶的方法，將記好數(shù)的蠶連同蠶網(wǎng)用剪刀剪下備用。